CRISPR/Cas9系统作为新一代基因编辑工具，因其构建方便、设计灵活，操作简单、效率高成本低，成为基因敲除的新一代利器。该系统由有DNA切割活性Cas9蛋白和识别特异靶点的sgRNA组成。Cas9是一种核酸内切酶，它和sgRNA构成的复合体能与DNA分子上的特定序列结合，并在PAM序列(几乎存在于所有基因)上游切断DNA双链。DNA被切断后，细胞会启动DNA损伤修复机制，造成基因的缺失、移码、插入等随机突变模式，达到修复双链断裂的目的，同时造成靶向基因敲除。
CRISPR/Cas9：稳定细胞系构建服务流程
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内容 |
详细信息 |
服务周期 |
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gRNA 设计合成及载体构建 |
gRNA 设计及合成 、载体构建、质粒测序及制备 |
2-3 周 |
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转染 |
慢病毒侵染 |
2-3 周 |
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单克隆细胞制备 |
单克隆细胞稀释培养、筛选、PCR鉴定、获得基因敲除单克隆细胞株 |
5-8 周 |
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鉴定 |
测序鉴定 |
2-3 周 |
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送货 |
提供项目COA、稳定克隆 |
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案例展示：
1．构建慢病毒载体的crispr sgRNA的单质粒系统。
2．经过293T细胞转染，包装得到慢病毒。
3．通过慢病毒转导的方式感染目的细胞。
4．通过抗生素筛选和单克隆挑取后，扩大培养。
5．经挑取单克隆细胞后，提取得到单克隆细胞的基因组DNA，再通过PCR扩增目的基因编辑位点的上下游区段，经过TA克隆连接到PMD19T的载体上，进行测序验证，选取10个菌落测序鉴定得到单克隆的细胞是否单一。
下图是交付给客户的单克隆细胞验证结果：
T7E1酶切法突变体检测试验检测CRISPR/Cas9的编辑效率：
918博天堂采用T7E1酶切法突变体检测试验检测CRISPR/Cas9的编辑效率。若sgRNA有效编辑了基因组DNA，则目的基因在修复后会出现碱基缺失突变现象，通过分析T7E1酶处理目标DNA片段的杂合链后的情况，从而验证Cas/sgRNA的编辑效率，用于筛选编辑效率高的sgRNA。
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